溶液中单分子电化学反应的直接成像
文章出处：Jinrun Dong, Yuxian Lu, 聪明的电话 Xu, Fanfan Chen, Jinmei 聪明的电话, Yuang Chen, Jiandong Feng. Direct imaging of single-molecule electrochemical reactions in solution. Nature 2021, 596, 244-249.
摘要：化学反应往往被概念化为单个分子转化为相应的产物，但通常是在探究整体平均行为的实验中观测到的。单分子方法超越了集合平均数，揭示了反应位置、途径和动力学的统计分布。目前，通过光学陷阱和扫描探针显微镜，可以在确定的位置以高空间分辨率观测到单个反应；并且使用超灵敏光探测器的现代光学方法，已经实现了高通量单分子测量。然而，有效探索单分子溶液化学反应仍然是一个挑战。在这篇文章中，作者演示了在水溶液中单分子电化学反应的光学成像和超分辨率显微镜的使用。该方法利用化学发光反应，在电极上电化学产生钌络合物，以确保最小的背景信号。这使得作者能够直接捕获单个反应的电化学发光的单光子，并开发超分辨电化学发光显微镜，以高时空分辨率成像活体细胞的粘附动力学。文章作者开发的方法预期将推进对电化学反应的基本理解，同时对生物分析和细胞成像有潜在的应用价值。
本文的实验是通过在一个观察通道中隔离电化学发光(ECL)反应进行的，在这个通道中，单分子ECL反应只能发射一个光子。作者采用了一个广泛探索的模型ECL系统即钌配合物三(2,2′-联吡啶基)钌(II)(Ru(bpy)32+)，通过共反应物三‐n‐丙胺(TPrA)再生。该体系通过如式(1)，(2)所示的氧化-还原机制生成ECL。
Ru(bpy)32+ - e- → Ru(bpy)33+ (1)
Ru(bpy)33+ + TPrA → Ru(bpy)32+· → Ru(bpy)32+ + hv (2)
结果表明，单个Ru(bpy)32+分子首先在氧化铟锡(ITO)电极表面发生多相电化学反应。在溶液中，TPrA的自由基在一个非常外放的均匀反应中还原生成了一个受激发的钌配合物，该配合物发射出一个能量为hv = 2 eV的单光子。
多次测量对大量的ECL反应进行求和，并给出发射光强度的平均值。此外，尽管ECL过程在单个纳米粒子表面的空间隔离提供了纳米粒子碰撞的随机信息，并使其成像成为可能，但观察水溶液中的单分子ECL反应要求不仅在空间上而且要在时间上隔离单个反应。
为了解决这一问题，作者开发了一种结合宽场光学成像和电化学记录系统的检测装置(见图1a)，用于监测水溶液中单分子钌基ECL反应。ECL反应由一个典型的三电极电化学池触发和控制，该电化学池产生工作电压，并用低噪声电流放大器记录电化学电流。作者制备了一个薄层的ITO电极，允许通过倒置显微镜进行同步的电化学测量和光学成像。随着偏压的加大，反应发生在表面的薄层ITO电极，发射出来的光子由底部的高数值孔径物镜收集回来，然后由高效、低噪的电子倍增电荷耦合装置相机检测。图1b所示的循环伏安法和ECL强度数据揭示了钌配合物的电化学反应过程与电压的函数关系。发光信号及其在618 nm (2 eV)处的发射光谱(图1c)表明收集到的光子是由ECL反应产生的。
如图1d-g所示，在1.4 V偏压的作用下，记录在单个图像像素上的光子强度表现出随机的开关行为，这是单分子反应的典型特征。电压的可逆切换揭示了随机光信号是由电压控制的。之后，作者探讨了这些反应的光子计数统计行为。值得注意的是，图1f显示了从这些爆发事件发出的离散光子数。检测到的事件在信噪比大于5的情况下，从相机偏移(ECL背景)中清晰地分辨出来。基于光信号的可逆性(图1g)，与测量的电化学电流(图1d)、发射光谱(图1c)的良好同步，以及光子数(图1f)与反应机理的对应关系(式(1)、(2))、作者将离散光子信号归因于单个ECL反应。
图1
作者能够观察单个反应，是因为快速摄像机记录和溶液中反应物的稀释确保了反应在时间和空间上的充分分离。如图2所示，增加曝光时间会导致从观察稀疏的单分子事件到相机饱和状态的转变。假设单分子在电极表面的碰撞遵循随机过程，可以用泊松分布来拟合光子数。
图2
钌基电化学反应可以是动力学控制或扩散控制。动力学信息是通过分析两个相邻事件之间的间隔时间(τoff)得到的(图3a)。在发射光子之前，Ru(bpy)32+首先扩散到电极表面，然后开始反应。因此，反应物的浓度在单分子观测中起着关键作用，其间隔时间(τoff)观察到的事件与钌络合物浓度成反比(图3b)，和每一帧图像中观察到的事件数量与浓度成正比(图3c)之间的关系。图3c中的线性关系与作者实验系统中单纯ITO表面的反应是完全扩散控制的，尽管由于电极表面纳米尺度的不均匀性和外加电压可能会有一些局部的动力学控制。
由于共反应物TPrA通常保持在相对较高的粗心的歌曲浓度(50 mM)，并且主要使用基于Ru(bpy)32+的ECL路线，因此作者只考虑Ru(bpy)32+分子的影响。分子在电场作用下的碰撞频率可以采用Smoluchowski扩散模型定量描述，该模型将碰撞频率与Ru(bpy)32+浓度联系起来。从图3c可以看出，在1.4 V的三次连续扫描的过程中，观察到的每帧事件数量相对于事件浓度的增加趋势是减小的。为了探究这一点，作者通过标准计时电流测量和拟合Cottrell方程确定了有效ITO面积，发现扫描间隔显著减少，这可能是由于ITO表面的纳米级不均匀性和重复扫描，由于TPrA反应产物的不可逆吸收或ITO的形态变化而耗尽有效反应位点表面。
图3
最小的背景信号(如不需要激光生成排放)和光学能力解决单个光子发射极耦合逻辑信号意味着作者开发的方法可以直接检测单电化学反应，但该方法的灵敏度还有待验证。由于Ru(bpy)32+/TPrA系统的有限ECL效率和光学装置有限的光子收集和探测效率，并不是所有的反应都能被观察到。因此，作者期望通过探索更高效的ECL系统和更高效的双目标光学装置，进一步提高系统的灵敏度。
利用光学检测单分子反应并成像其空间位置的能力，作者将定位显微镜的基本原理应用于ECL反应位点测绘。Ru(bpy)32+分子在溶液中扩散，多次瞄准ITO表面的反应位点(图4a)，因此在单分子重复碰撞后积累了大量的ECL反应局域。这种积累提高了单个反应位点的定位精度。
成像能力的基准测试是在微制的ITO电极模板上完成的，该模板通过高分辨率电子显微镜、元素映射分析和高度分析进行表征(图4b)。然后作者对同一样本进行单分子ECL。虽然单个事件的定位精度较低，因为只有一个或几个光子捕获在一个突然事件，在同一反应网格重复的碰撞导致多个定位集群(图4)，并使ITO表面的重建图像的采集时间为115秒(图4d)。扫描电子显微镜(图4b，c)显示的空间模式与超分辨ECL图像(图4d，e)之间的相关性非常好，验证了作者的方法。在Ru(bpy)32+的长寿命(在25°C的水中约为0.64 μs)期间，在发射光子之前，它可以扩散到离反应位点约20 nm的地方，因此探测位点与反应位点不同。采用标准昏睡的板凳叶环相关(FRC)方法对图像分辨率进行量化，分辨率可降至22 nm(图4g)。定位分析进一步包含定量信息，反映在不同区域的定位分子数量(图4h)。
这些发现证明了一种不需要激光激发的超分辨率显微镜。尽管成像仍然局限于表面，但采用分离光束路径或点扩展函数工程的策略可能会实现三维成像。基于ECL的成像方法的一个独特特点是，由于不使用光激发，背景最小化到相机偏移水平，从而提供了超高的灵敏度来分辨单个光子。此外，单分子ECL可以通过施加的电压进行时空控制，最终驱动光子发射，以满足动态成像的要求。
图4
接下来，作者探索了用于细胞成像的单分子ECL。细胞与细胞外基质的粘附是细胞迁移、增殖等许多基本生物学过程中的一个重要过程。活细胞粘附的成像需要一种具有良好空间分辨率的技术来显示局部粘附，同时需要足够的时间分辨率。超分辨率荧光显微镜可以满足这些要求，但必须用荧光标记粘附蛋白非常繁琐，而且会扰乱活细胞。ECL显微镜已经被证明不需要对细胞成像进行直接标记，但其分辨率太有限，无法显示更详细的粘附结构。当单个细胞用单分子ECL直接在ITO表面成像时(图5a)，细胞的粘附区域阻止了ECL反应物扩散到ITO表面的反应位点。与暴露的ITO表面积相比，这导致了深色对比，从而在不直接标记粘附蛋白的情况下解决了细胞粘附位点。
超分辨率荧光成像技术和单分子ECL均可以成像相同的固定细胞，但前者显示标记蛋白集群在粘着斑，而后者显示整体细胞粘附。由于灵敏度和动态控制，作者可以有效地利用ECL信号进行快速图像重建。活体人类胚胎肾293 (HEK293)细胞的超分辨ECL图像如图5b、d所示，与亮场图像(图5a)和衍射限制ECL图像(图5c)相比，显示了特定的信息。作者进一步探讨细胞粘附的动态过程，观察到胶的运动区域，具有12秒的时间分辨率和150 nm的空间分辨率，由FRC映射，已经与优化超分辨率荧光显微镜成像焦粘连。通过对动态过程的分析(图5g)，作者得到了图5e区域的平均移动速度为2.28 μm2 min-1，图5f区域的平均移动速度为1.70 μm2 min-1。
图5
单分子ECL显微镜可以发展为实现细胞结构的靶向可视化，钌基探针可以用于细胞结构的锚定。与荧光显微镜一样，通过捕获固定探针分子多次激发过程发出的光子来进行信号放大，可以进一步提高该方法的成像能力和特异性。虽然ECL避免了激光诱导的问题，如光漂白和自荧光的干扰，但是使用电压和ECL探针可能会潜在地影响细胞。尽管如此，作者相信单分子ECL为基于荧光的单分子成像方法提供了替代和补充的机会，对生物分析和细胞成像应用有潜在的应用价值。