作者|lkdjd
日本东京大学的研究人员开发了一种方法，可以提高现有定量相位成像的灵敏度，同时可以看到活细胞中从微小颗粒到大结构的所有结构。图片：s-graphics.co.jp
2021年初，显微镜技术也迎来了新的飞跃。
光物理学家开发了一种新方法，通过使用现有的显微镜技术，在不添加染料或荧光染料的情况下，更详细地观察活细胞内部。
一种荧光寿命显微镜技术，可以用频率梳代替机械部件观察动态生物现象。
“我认为无标签技术将是一个重要的研究方向。特别是以无标记的方式测量细胞内外的病毒、异物等小颗粒的技术，将是未来成像设备的一个趋势。”
其中一项研究的负责人、日本东京大学光子科学技术研究所副教授Takuro Ideguchi在接受《中国科学报》采访时表示。
宽范围和较小的相变
因为单个细胞几乎是半透明的，显微镜摄像头必须能够检测到穿过一些细胞的光线的极其细微的差异。这些差异被称为光的相位。相机图像传感器受限于它们能够检测到的光学相位差，即动态范围。
“为了用同样的图像传感器看到更详细的信息，我们必须扩大动态范围，这样我们才能检测到更小的光相位变化。”
Ideguchi说，“更大的动态范围允许我们测量大小相位图像。比如测量一个细胞，细胞的主干会产生很大的相变，而细胞内的小颗粒/小分子会产生很小的相变。为了将它们可视化，我们必须扩大测量的动态范围。”
研究小组开发了一种技术，通过两次曝光分别测量光相位的大小变化，然后无缝连接它们以创建详细的最终图像。
他们将这种方法命名为自适应动态范围偏移定量相位成像(ROFFE-QPI)。相关论文近期发表于《光：科学与应用》。
长期以来，定量相位成像是观察单个细胞的有力工具，可以让研究人员进行详细的测量，比如根据光波的位移来跟踪细胞的生长速度。然而，由于图像传感器的低饱和容量，这种方法不能跟踪细胞内和细胞周围的纳米粒子。
新方法克服了定量相位成像动态范围的限制。在offer-QPI中，相机需要两次曝光才能产生最终图像，其灵敏度是传统定量相位显微镜的7倍。
两次曝光告别了光毒性
第一次曝光是将常规定量相位成像产生的——平光脉冲指向样品，测量光通过样品后的相移。计算机图像分析程序基于第一曝光图像快速设计反射样本图像。
然后，研究人员使用一种称为波前成形装置的独立部件，产生一种具有更高强度光的“光雕塑”，以获得更强的照明，然后对样本进行脉冲，进行第二次曝光。
如果第一次曝光产生的图像是样品的完美代表，那么第二次曝光的雕刻光波会以不同的相位进入并穿过样品，最终只会看到一个暗像。
“有趣的是，我们在某种程度上抹去了样本的图像。事实上，我们几乎不想看到任何东西。我们去掉了大的结构，这样我们就可以看到小的细节。”
Ideguchi解释说，由于第一次测量中的大相位物体，较小的相位物体由于动态范围的限制而无法可视化，研究人员称之为“洗掉”。
他们需要第二次测量来观察动态范围移动的小相位物体的细节。
此外，这种方法不需要特殊的激光、显微镜或图像传感器，研究人员可以使用活细胞，也不需要任何染色或荧光，因此光毒性的可能性很小。
光毒性是指用光杀死细胞，这也是荧光成像等其他成像技术面临的问题。
改进的荧光成像
事实上，荧光显微镜在生物化学和生命科学中被广泛使用，因为它允许科学家直接观察细胞及其周围的一些化合物。荧光分子可以吸收特定波长范围内的光，然后在更长的波长范围内重新发射。
然而，传统荧光显微镜的主要局限性是其结果难以定量评价，荧光强度受实验条件和荧光物质浓度的影响显著。现在，一项新的研究将彻底改变荧光显微镜的领域。
当荧光物质受到短脉冲光照射时，产生的荧光不会立即消失，而是随着时间的推移而“衰减”。
但荧光衰减太快，普通相机无法捕捉到。虽然可以使用单点光电探测器，但必须扫描整个样本区域，才能从每个测量点重建完整的二维图像。这个过程涉及到机械零件的运动，极大地限制了图像捕捉的速度。
幸运的是，在最近发表于《科学进展》的一项研究中，科学家们开发了一种无需机械扫描即可获得荧光寿命图像的新方法。
领导这项研究的日本德岛大学后LED光子学研究所教授Takeshi Yasui告诉记者，“我们可以在2D空间同时绘制44400个‘秒表’来测量荧光寿命——，所有这些都是在一次拍摄中完成的，无需扫描。”
研究人员使用光频梳作为样品的激发光。光频梳本质上是一种光信号，它们之间的间隔是恒定的。
研究人员将一对激发频率梳信号分解成强度调制频率不同的单拍信号(双梳拍)，每一拍携带一个单一的调制频率并照射目标样本。
此外，每个光束在不同的空间位置击中样品，在样品的二维表面上的每个点和双梳拍的每个调制频率之间形成一一对应。
研究人员的数学
方法将测量信号转换为频域信号，根据调制频率处的激发信号与测量信号之间存在的相位延迟，计算出每个像素处的荧光寿命。Yasui表示，这将有助于动态观察活细胞，还可以用于多个样本的同时成像和抗原检测——这种方法已经被用于新冠肺炎的诊断。该技术还有助于开发出新的顽固性疾病疗法，提高预期寿命。
同样，Ideguchi也提到，ADRIFT-QPI能够在整个活细胞的背景下看到微小颗粒，而不需要任何标签或染色。
“该技术可以检测到来自纳米级粒子的细小信号，比如病毒或在细胞内外移动的粒子，这样就可以同时观察它们的行为和细胞的状态。”
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41377-020-00435-z
https://doi.org/10.1126/sciadv.abd2102
《中国科学报》 (2021-01-07 第2版 国际)
编辑 | 赵路
排版 | 志海